Ein digitales Mikroskop zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass es die schnelle und problemlose Erstellung von Oberflächenmodellen makro- und mikroskopischer Strukturen ermöglicht. Diese führen einerseits bei einer qualitativen Bewertung zu einem besseren Verständnis und einer detaillierten Dokumentation der Probe. Andererseits kann durch die Quantifizierung der Oberfläche wertvolle Information zur Oberflächenbeschaffenheit oder deren Verschleiß gewonnen werden. Welche Proben lassen sich mit einem Digitalmikroskop optimal untersuchen? Wo liegen die Grenzen der eingesetzten Methode?
Die Digitalmikroskope der Leica DVM-Serie nutzen das Prinzip der Fokusvariation, um ein dreidimensionales Bild zu erzeugen. Die begrenzte Schärfentiefe der Optik wird ausgenutzt, um die Tiefeninformation der Probe zu ermitteln. Durch vertikales Verfahren der Probe relativ zum Objektiv wird die Schärfeinformation zusammen mit dem Abstand zur Optik ermittelt. Bei jeder vertikalen Position wird jeweils der scharfe vom unscharfen Bereich des Bildes getrennt und von der Software zu einem Oberflächenmodell verarbeitet. Einer der Vorteile dieses Verfahrens ist, dass zusätzlich zur Höheninformation auch die Textur der Probe dokumentiert wird. Welche Einflussgrößen sind ausschlaggebend für eine erfolgreiche Erstellung eines 3D-Oberflächenmodells und wie beeinflussen diese Größen die laterale und vertikale Auflösung?
Optik
Schärfentiefe ist in der Mikroskopie eine oft empirisch verstandene Messgröße. In der Praxis bestimmen die Zusammenhänge zwischen numerischer Apertur, Auflösung und Vergrößerung diesen Parameter. Moderne Mikroskope erzeugen mit ihren Einstellmöglichkeiten eine für den visuellen Eindruck optimale Balance zwischen Schärfentiefe und Auflösung – zwei Parameter, die sich prinzipiell gegenläufig verhalten.
In DIN/ISO-Normen wird die objektseitige Schärfentiefe definiert als „axiale Tiefe des Raums beidseitig der Objektebene, in dem das Objekt ohne nachweisbaren Schärfeverlust bewegt werden kann, während die Positionen von Bildebene und Objektiv unverändert bleiben“. Wie die Nachweisgrenze des Schärfeverlustes ermittelt werden sollte, dazu liefert die Norm allerdings keinen Hinweis. Insbesondere bei niedrigen Vergrößerungen lässt sich die Schärfentiefe durch Abblenden, das heißt durch Verkleinern der numerischen Apertur, stark erhöhen. Dies erfolgt üblicherweise mit der Aperturblende bzw. einer Blende, die auf einer konjugierten Ebene zu dieser liegt. Mit geringer werdender numerischer Apertur nimmt aber auch die laterale Auflösung ab. Es gilt je nach Objektstruktur die optimale Balance zwischen Auflösung und Schärfentiefe zu finden.
Textur der Probe
Die Beschaffenheit der Probenoberfläche, umfasst die Gesamtheit der Merkmale und Merkmalswerte der Probe. Es handelt sich hierbei um farbliche sowie Helligkeitsmerkmale der Oberfläche. Das Prinzip der Fokusvariation beruht auf dem eingangs beschrieben methodischen Ansatz. Je besser die Probe in scharfe und unscharfe Bereich unterteilt werden kann, desto genauer das Oberflächenmodell. Vor allem Texturen, die über einen guten Kontrast verfügen, eignen sich hervorragend für diese Methode. Die Beleuchtung spielt, wie in vielen Anwendungsbereichen der Mikroskopie, auch hier eine wichtige Rolle, da sie über Erfolg oder Misserfolg mitentscheidet. Durch Auswahl einer geeigneten Beleuchtung kann auch eine Probe mit geringer Textur mit diesem Verfahren durch ein Oberflächenmodell dokumentiert werden. Beispielsweise bringt eine Auflicht-Schrägbeleuchtung auch versteckte Strukturen zum Vorschein.
Mechanische Auflösung in vertikaler Richtung
Der dritte Einflussfaktor ist die mechanische Auflösung in vertikaler Richtung. Unter diesem Begriff versteht man die kleinsten möglichen Schritte in z-Richtung des in der Regel motorisierten Fokustriebs. Um die Leistungsfähigkeit der Optik auszunutzen, muss der kleinste mögliche Schritt jeweils kleiner als die aktuell genutzte Schärfentiefe sein, da sonst Bildinformationen verloren gehen. Ein motorisierter Fokustrieb mit beispielsweise 10 μm Auflösung ist geeignet bei einer Schärfentiefe von 15 μm. Die lateralen und vertikalen Auflösungen, die mit einem Leica Digitalmikroskop erreicht werden können, hängen von verschiedenen Einflussgrößen wie Oberflächenstruktur oder Beleuchtung ab. Sie müssen daher für jede Anwendung individuell ermittelt werden. Durch Interpolation wird eine vertikale Auflösung von der Hälfte der angewendeten Schärfentiefe erreicht. Die laterale Auflösung wird bestimmt durch die numerische Apertur der verwendeten Vergrößerung.
Leica Mirosystems, Wetzlar www.leica-microsystems.com
Schärfentiefe
Die Bereksche Formel
Die älteste Publikation zur visuell empfundenen Schärfentiefe stammt von Max Berek. Bereits 1927 hat er die Resultate seiner umfangreichen Versuche veröffentlicht. Für die visuelle Schärfentiefe liefert die Bereksche Formel praxistaugliche Werte und wird deshalb auch heute noch angewendet. In vereinfachter Form lautet sie:
TVIS = n·[ λ/(2·NA2) + 340 μm/(NA·MTOT VIS)]
TVIS: visuell empfundene Schärfentiefe
n: Brechungsindex des Mediums, in dem sich das Objekt befindet.
λ: Wellenlänge des benutzten Lichts, bei Weißlicht ist λ= 0,55 μm
NA: objektseitige numerische Apertur
MTOT VIS: visuelle Gesamtvergrößerung des Mikroskops
Ersetzt man in der obigen Gleichung die visuelle Gesamtvergrößerung durch die Beziehung der förderlichen Vergrößerung (M TOT VIS = 500 bis 1000·NA), wird deutlich, dass sich die Schärfentiefe in erster Näherung umgekehrt proportional zur numerischen Apertur im Quadrat verhält.
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